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WB (Western Blot) 学习笔记——ECL法环球观热点

2023-07-01 01:25:16来源：哔哩哔哩

蛋白质印迹 (Western blot, WB) 是一种通过凝胶电泳分离蛋白质，将其印迹转移到膜上，并对固定抗原进行选择性免疫检测的技术。这是一种重要的常规蛋白质分析方法，依赖于抗体-抗原相互作用的特异性，对于从复杂混合物中定性或半定量鉴定特定蛋白质及其分子量非常有用。

原理：

【资料图】

WB从复杂的蛋白质混合物开始，通过凝胶电泳利用电荷和分子质量将其分离，并将分离的蛋白质印迹转移到膜上。然后将膜培养在含有已知能与目的蛋白结合的抗体（一抗）溶液中孵育，该过程中一抗与目的蛋白结合。此后将膜培养在含有已知能与一抗结合的抗体（二抗）溶液中孵育，该过程中二抗与一抗结合，抗体形成蛋白 (protein of interest) -抗体 (primary antibody) -抗体 (secondary antibody) -HRP (peroxidase) 支架。ECL底物 (ECL substrate) 中含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）作用下可发出荧光，即可用化学发光检测支架。支架以特定分子量的“带”形式存在，将膜上的条带与分子量标记进行比较，可确定样品中是否存在目的蛋白并提供有关其分子量的信息。

实验流程:

1. 电泳 (SDS-PAGE)

. 制胶

. 分离胶：将玻璃板叠放整齐（避免漏胶）并夹好固定于底座上，同时确定灌胶位置。配置分离胶并混匀，将制好的分离胶滴入玻璃板间（需使胶沿玻璃板流下避免气泡产生）直至确定好的位置处。加水液封（速度需慢避免将胶冲变形）后静置，待胶充分凝固后倒去上层水或用滤纸吸去水层。

. 浓缩胶：配置浓缩胶并混匀，将制好的浓缩胶滴入玻璃板间（操作同分离胶）。轻轻插入梳子后静置，待胶充分凝固即制成胶板。

. 上样电泳

. 对照：(i) marker：预染或非预染的已知分子量蛋白质混合物，可指示蛋白质条带大小和示踪；(ii) 阳性对照：目的蛋白或已知表达目的蛋白的细胞系或组织裂解物，可检验实验有效性；(iii) 阴性对照：已知不表达目的蛋白的细胞系或组织裂解物，可检查是否存在非特异性结合及假阳性；(iv) 上样对照：管家蛋白抗体或在几乎所有组织细胞中表达水平相当的蛋白质，可确保凝胶中所有泳道含有等量样品并估量样品中蛋白质量；(v) 无一抗对照：只加二抗未加一抗，可指示是否存在由于二抗的非特异性结合而造成的任何非特异性结合或假阳性；(vi) 内源性对照裂解物：重组蛋白质样品。

. 上样：将胶板放入电泳槽中固定（通常两块凝胶板共用一个电源架，凹沿面需靠向电源架；若只跑一块胶，另一边需垫塑料板），按要求加入电泳缓冲液（电泳液至少漫过内侧小玻璃板）。拔出梳子（两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拔出），用微量进样器吸取适量样品液（需避免吸入气泡）并将样品液缓慢加入凝胶板内加样孔（加样过快可能使样品冲出加样孔）。

. 电泳：连接导线（注意正负极），上层胶用低压恒压电泳，溴酚蓝进入下层胶后用高压恒压电泳，待溴酚蓝到达胶板底端附近停止电泳。

2. 转膜

. 膜的选择：根据蛋白特性及分子大小等因素选择合适杂交膜，WB常用的膜主要有NC膜和PVDF膜。(i) NC膜：与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；膜韧性较差易损坏。(ii) PVDF膜：与蛋白质亲和力高，但用前需在甲醇中浸泡以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合，适合低分子量蛋白的检测。

. 转膜（湿式）：配置转膜液，将转膜所需器具浸入加有转移液的托盘中，并在转膜液中预先赶走海绵垫中气泡。将凝胶板玻璃轻轻撬开，除去浓缩胶并将分离胶从玻璃板上剥离（可在加有转移液的托盘中操作）并标记样品顺序（切去胶的一个小角）。裁剪合适大小的膜（与分离胶大小相同）并在与胶相同位置剪去一小角指示电泳方向及吸附有蛋白的膜面，PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和而NC膜不需要。在转膜装置上从负极（黑底）到正极依次放置海绵垫、滤纸、分离胶、膜、滤纸和海绵垫片（由下而上；若海绵垫足够厚可不需滤纸），放置时每层都需除气泡。（涉及到胶的操作必须轻柔以避免将胶弄破）将转膜装置放入转膜槽中（注意正负极），由于转膜时放热，可在槽的一边放冰并将转膜槽埋于冰中，设置好电压和时间进行转膜。

3. 封闭

. 封闭剂的选择：为防止杂交膜上非特异性蛋白质结合位点与抗体结合引起非特异性染色和背景，需用惰性蛋白或非离子去污剂封闭膜上未结合位点，封闭剂应封闭所有未结合位点而不替换膜上的目的蛋白、不结合目的蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常见封闭剂有BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-20（ - %）稀溶液 PBST 或者 TBST。

. 封闭：将膜置于适宜封闭剂中于室温下缓慢震荡1-2h，封闭完成后进行洗膜（TBST溶液）。

4. 抗体孵育

用封闭液稀释一抗至适宜浓度（说明书建议或一般推荐倍数1:1000-1:2000），从封闭液中取出膜置于保鲜膜内并将稀释好的一抗溶液滴入保鲜膜中，滴好后赶出保鲜膜中残留气泡并封好保鲜膜。将膜于4℃下在摇床上孵育过夜，孵育完成后吸取一抗并洗膜。同上述方法进行二抗孵育（1-2h），孵育完成后洗膜。

5. 化学发光

配置发光液（注意避光），吸取适量发光液覆盖至膜上并于ECL发光仪上曝光采集图像进行分析。

参考：

[1] Hirano, S. (2012). Western Blot Analysis. In: Reineke, J. (eds) Nanotoxicity. Methods in Molecular Biology, vol 926. Humana Press, Totowa, NJ. /978-1-62703-002-1_6

[2] Hnasko, ., Hnasko, . (2015). The Western Blot. In: Hnasko, R. (eds) ELISA. Methods in Molecular Biology, vol 1318. Humana Press, New York, NY. /978-1-4939-2742-5_9

[3] Kim, B. (2017). Western Blot Techniques. In: Espina, V. (eds) Molecular Profiling. Methods in Molecular Biology, vol 1606. Humana Press, New York, NY. /978-1-4939-6990-6_9

[4] 无锡菩禾生物医药技术有限公司

[5] 刘忠民，常晓彤. 临床分子生物学检验技术实验指导[M]. 武汉：华中科学技术大学出版社, 2020.

[6] 叶棋浓.生物实验室系列现代分子生物学技术与实验技巧[M].北京：化学工业出版社.2015.

[7] 马文丽. 分子生物学实验手册[M]. 北京：人民军医出版社, 2011.

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